ウイルスを「殺す」6つの方法：新型コロナウイルスに最適なのはどれか？

この記事では、ウイルスを不活性化するいくつかの方法とその不活性化原理をまとめています。これに基づいて、誰もが適切な消毒方法を見つけることができます。同時に、不活化COVID-19ワクチンの開発の余地がさらに広がる可能性も見えてくるだろう。

著者：Peng Cheng（清華大学Li Sai研究室の博士課程学生）、Li Sai（清華大学構造生物学先端イノベーションセンター研究員）

人類の発展の歴史は、ウイルスとの戦いの歴史でもあります。歴史を振り返ると、ウイルスは人類に対して数え切れないほどの激しい攻撃を仕掛けてきました。天然痘ウイルスは1万年以上前に出現し、1980年まで世界中で猛威を振るっていたと推定されています。天然痘は死亡率が高く、20世紀だけでも世界中で推定3億人が死亡しています[1]。インフルエンザウイルスは過去100年間に何度も世界中で大混乱を引き起こしており、1918年のスペインかぜだけでも数千万人の命が奪われました[2]。さらに、ヒト免疫不全ウイルス（通称「HIV」）、エボラウイルス、肝炎ウイルスは依然として人類を狙っており、現在の新型コロナウイルスは変異株の出現が続いているため、強い感染力を示し続けています。これまでのところ、この新たなコロナウイルスの流行による死者数は、人類史上のウイルスによる疫病による死者数の中で第3位にまで上昇している（Wikipediaより）。この目に見えない敵を前にして、人間はいくぶん受動的になっているようだ。私たちは率先してウイルスを「殺す」ことはできないのでしょうか？

実際、人類はウイルスの存在を知る前から、手探りでウイルスを「殺す」方法をすでにいくつか見つけ出していた。古代中国の医学にもこれに関する記録があり、いくつかの方法は今日でも科学的な指導的意義を持っています。例えば、李時珍が『本草綱目』に記したように、「疫病が発生したら、患者の衣服を脱がせて蒸し器で蒸すと、家族全員が感染しない」というのです。これは高温を利用してウイルスを「殺す」例です。生物学、物理学、現代医学、化学の進歩により、ウイルスに対する人類の認識は「悪霊」や「神の罰」から「寄生を専門とする小さな生物学的粒子」へと変化し、ウイルスを「殺す」手段の開発の生物学的根拠も提供しました。

今日では、ウイルスを「殺す」ためのさまざまな方法があります。アルコール（カプセルの破壊）や高温（タンパク質の変性）など、ウイルスの構造を破壊し、ウイルスを素早く「殺す」ことができるものもあります。これらも消毒の一般的な方法です。ホルムアルデヒド（タンパク質を固定）やβ-プロピオラクトン（核酸を破壊）など、ウイルスを「殺す」ことを基本として、ウイルスの免疫原性や構造の完全性を維持できる方法もあります。ウイルスが彼らによって「殺された」後、それはワクチンの製造やウイルスの構造生物学研究に使用されることが多い。

どうすればウイルスを「殺す」ことができるのでしょうか?

実際のところ、「ウイルスを殺す」という表現は正確ではありません。ウイルスは、自然が「ミニマリスト」スタイルで設計した生物の 1 つと言えます。その構造は非常に単純で、タンパク質/脂質膜に包まれた核酸のみで構成されています。体外では自己複製できず、エネルギー消費もなく、物質の合成や分解も行われません。どうやら「死んだ」状態にあるようです。しかし、一度細胞に侵入すると、細胞全体を自身の生産工場に変え、さらに多くのウイルス粒子を増殖させることができます。したがって、ウイルスが生きているかどうかという疑問に対する明確な答えはありません。前回の記事で述べた「殺す」というのは、実際にはウイルスの増殖能力を失わせること、つまり、ウイルスが宿主に遭遇しても「復活」しないようにすることを意味します。試験管内では、このプロセスはウイルス学界では「不活性化」として知られています。

ウイルスの増殖を阻止したい場合、まずウイルスのライフサイクルを理解する必要があります。ウイルス粒子は、その表面にあるタンパク質を「鍵」として使い、宿主を識別して細胞内に侵入し、細胞の原材料とエネルギーを使って自身のゲノムを複製し、独自のタンパク質を合成します。これらの新しく合成されたゲノムと構造タンパク質は、子孫ウイルス粒子に組み立てられ、細胞外に放出されます。ウイルスの生命活動に関しては、一般的にそれを不活性化する方法が3つあります。 1つは、ウイルスの全体構造またはウイルスのタンパク質構造を破壊し、細胞に侵入する能力を失わせることです。もう 1 つは、ウイルスのタンパク質を「ロック」して機能できないようにすることです。最後は、ウイルスのゲノムを破壊して、そのゲノムが細胞内で複製できないようにすることです。

新しいコロナウイルスとインフルエンザウイルスのライフサイクル[3]。

新しいコロナウイルス（左）とインフルエンザウイルス（右）のライフサイクルは、次の手順で進みます。

①セルを入力します。ウイルス粒子の表面タンパク質が受容体を認識し、膜融合が起こり、遺伝物質が放出されます。

②ゲノム複製。新型コロナウイルスは、細胞にゲノム複製の場として二重膜小胞（DMV）[4]の生成を誘導しますが、インフルエンザウイルスは細胞核内でゲノムを複製します。

③ウイルスタンパク質の翻訳

④ ウイルス粒子の集合と出芽。新しいコロナウイルスの組み立ては小胞体ゴルジ体中間体（ERGIC）で起こりますが、インフルエンザウイルスは細胞膜上で組み立てられます。

⑤子孫ウイルスの放出。

上記のアイデアをもとに、さまざまなウイルス不活化方法が生まれてきました。不活化の方法により、化学的不活化と物理的不活化に分けられます。不活化方法によって、ウイルスに対する影響は異なります。ウイルスを素早く不活性化できる方法もあれば、ウイルスを不活性化しながらもウイルスのタンパク質構造や免疫原性を維持できる方法もあります。科学者たちはまた、迅速な消毒方法の確立、ウイルスの構造分析、不活化ワクチンの開発など、さまざまな不活化方法に基づいた下流の科学研究も行っている。この記事では、いくつかの主要なウイルス不活化方法と原理を簡単に紹介します。

化学的不活性化

ホルムアルデヒド

誰もがホルムアルデヒドについて知っているはずです。その水溶液は、保存料や固定剤として有名なホルマリンです。ホルムアルデヒドは中心の炭素原子に電子が欠けており、求電子性があるため、求核剤との求核付加反応を起こすことができます。タンパク質の窒素末端のアミノ基と側鎖の窒素含有アミノ酸（リジン、アルギニン、チロシンなど）をモノヒドロキシ化し、さらに脱水してイミン中間体を形成し、これがアルギニンとチロシンの残基と再び反応してメチレン橋と架橋を形成します。さらに、ホルムアルデヒドはアデニンをモノヒドロキシ化し、遺伝子の読み取りを妨げることもあります[5]。したがって、ホルムアルデヒドはウイルスのタンパク質とゲノムに二重の打撃を与えるだけでなく、架橋を通じてウイルスのタンパク質の構造を固定することもできます。ホルムアルデヒドはタンパク質構造を「ロック」することができるため、ホルムアルデヒドによる不活化は不活化ワクチン開発の主要な候補であるだけでなく、構造生物学者がウイルス構造の分析に使用する一般的なウイルス不活化方法でもあります[6]。

ホルムアルデヒドとアデニンおよびリジンの反応原理[5]

β-プロピオラクトン

β-プロピオラクトンは、主にグアニンを標的とするアルキル化剤であり、核酸を損傷する傾向がある不活性化剤とも考えられています。求電子性β-プロピオラクトンはグアニンとの求核置換反応を起こし、β-プロピオラクトンの環開裂とグアニンのアルキル化を引き起こし、ウイルスゲノムの不活性化につながる[5]。現在、β-プロピオラクトンは不活化ワクチンの開発において最も広く使用されている不活化剤ですが、研究により、β-プロピオラクトンはいくつかのアミノ酸を修飾し、アシル化および架橋反応を引き起こすこともできることが示されています[7]。

β-プロピオラクトンとグアニンの反応原理[5]

エタノール

エタノールはアルコールです。エタノールは、特にエンベロープウイルスなどのウイルスを非常に速く不活性化します。エンベロープウイルスは脂質二重層に囲まれたタイプのウイルスです。エタノールは脂質と親水性の両方の性質を持つため、膜の水に対する親和性を高めながら、非極性アミノ酸残基間の相互作用を減少させ、それによってウイルスの全体構造を破壊し、ウイルスタンパク質を変性させることができる[8]。

2021年、Das et al.分子動力学シミュレーションを通じて、エタノールがエンベロープウイルスに与える破壊効果を説明した。ウイルスを75％エタノール溶液に浸すと、エンベロープが崩壊し、内容物が放出される[9]。新型コロナウイルスもエンベロープウイルスです。 2020年、アニカ・クラッツェルは実験により、新型コロナウイルスを30％以上のアルコール濃度の溶液に30秒間浸すと、感染力が背景レベルまで低下することを発見した[10]。エタノールに加えて、n-プロパノールやイソプロパノールなど、他の多くのアルコール化合物もより速い不活化速度を示す可能性があります[10]。これらの化合物は不活性化が速く、毒性が低いという特徴があるため、手指消毒剤や物体の表面消毒剤の主成分としてよく使用されています。

アルコール化合物が新型コロナウイルスを破壊するメカニズムの模式図[8]

物理的な不活性化

温度

高温も一般的かつ広く使用されている不活性化方法です。高温の影響により、ウイルスタンパク質の二次構造と三次構造を維持する化学結合が破壊され、タンパク質の変性が起こり、ウイルスは細胞に感染して複製する能力を失います。 Didac Martí 他カタルーニャ工科大学の研究者らは分子動力学シミュレーションを用いて、高温が新型コロナウイルスの表面のタンパク質、特に表面タンパク質の受容体結合領域の構造変化と水素結合の再配置を引き起こす可能性があることを発見した[11]。さらに、高温は核酸の骨格を破壊する可能性もあります。

注目すべきは、現在では「低い」高温（41​​℃以下）であれば、タンパク質の構造や機能に影響を与えずにウイルスのゲノムを破壊することができると考えられていることである[5]。 2020年にパスツール研究所のクリストフ・バテジャは、新型コロナウイルスの鼻咽頭スワブサンプルを56℃、65℃、95℃の高温処理にかけたところ、新型コロナウイルスはそれぞれ20分、10分、3分後に不活化されることを発見した[12]。高温不活化は、その安定した広範囲の作用のため、現在ではバイオセーフティ廃棄物処理において必須のステップとなっています。

紫外線

紫外線は青紫色光よりも周波数が高い目に見えない光です。国際標準化機構（ISO）の規格によれば、紫外線は波長によってさらにUVA帯（320〜400nm）、UVB帯（280〜320nm）、UVC帯（200〜280nm）に分けられます。その中でも、UVCはウイルスに対して最も破壊力があり、次いでUVBとUVAと続きます[13]。そのため、UVCはウイルスを不活性化するために使用される主な帯域でもあります。

紫外線がウイルスの核酸を破壊する主な方法は、核酸内部にピリミジン二量体の形成を誘導することです。ウイルスの核酸が紫外線を吸収すると、ウイルスゲノム内の隣接するまたは反対側にある 2 つのピリミジンが光化学的に融合し、共有結合したピリミジン二量体を形成します。共有結合相互作用により、ピリミジン二量体はゲノムバックボーンに張力を導入し、バックボーンの破壊を引き起こします[5]。いくつかのウイルスでは、紫外線は融合活性を維持しながらウイルスを完全に不活性化することができます[14]。新型コロナウイルスの場合、9分間のUVC照射（累積線量1048 mJ/cm2）で、感染力の高い新型コロナウイルス（5 * 106 TCID50/mL）を完全に不活化できる[13]。 UVCは不活化効果は優れていますが、浸透力は低いです。通常の透明ガラス、衣服、プラスチックなどは、ほとんどの UVC を遮断できます。そのため、UVC は病院やバイオセーフティグレードの実験室の器具や物品の表面、屋内空間の消毒によく使用されます。

紫外線照射下で隣接するウラシルによるピリミジン二量体の形成の模式図[5]

電離放射線

電離放射線は、物質の原子または分子を電離させるエネルギーです。主な電離放射線技術は、ガンマ線、電子線、X 線の 3 つです。ガンマ線は原子が崩壊して分解するときに放出される放射線です。電子ビーム（eBeam）は、電子ビーム加速器から生成される高エネルギー電子ビームです。 X線は原子核の外側での電子の遷移または刺激によって生成される放射線である[15]。発生源は異なりますが、ウイルス不活化のメカニズムは基本的に同様です。

電離放射線がウイルスに及ぼす破壊的な影響は、直接的な影響と間接的な影響に分けられます。電離放射線はウイルス内の分子の化学結合を直接破壊し、水分子を電離させることもできます。水分子の放射線分解により、反応性の高いさまざまなフリーラジカルが生成されます。これらのフリーラジカルは極めて短時間しか存在しないが、周囲のタンパク質や核酸と反応して大きな損傷を引き起こし、間接的にウイルスに損傷を与える可能性がある[15]。しかし、電離放射線はタンパク質ではなくウイルスのゲノムを主に攻撃すると考える人もいます[16]。電離放射線の不活化効果は放射線量と関連しており、ウイルスによって大きく異なります[16]。放射線源技術の更新と進歩に伴い、電離放射線不活化技術はワクチンの研究開発、輸入国でのコールドチェーン包装の消毒などの分野でも使用され始めています。

不活化ウイルスは不活化ワクチンですか？

ウイルスの不活化について語るとき、当然ながら不活化ワクチンの話題を避けることはできません。ワクチンの役割は、私たちの体が抗原特異的な適応免疫を獲得できるようにすることです。アジュバントの助けにより、ワクチンの特異的免疫原性により特異的免疫記憶を確立することができます。次回同じ病原体が侵入した場合、体は対応する免疫システムを素早く活性化し、病原体を素早く排除することができます[17]。ワクチンを介した免疫記憶の確立においては、ワクチンの免疫原性が重要な役割を果たしており、不活化ワクチンも例外ではありません。

不活化ウイルスにはある程度の安全性がありますが、すべての不活化ウイルスが適切な免疫原性を保持しているわけではありません。分子の観点から見ると、免疫原性の保持はウイルス表面タンパク質の完全性と完全性の保持を意味します。上記からわかるように、ウイルスの不活化のプロセスは必然的にタンパク質構造に影響を与えます。したがって、不活化ワクチンの開発プロセスでは、ウイルスの免疫原性を可能な限り高めながら、ウイルスの安定的かつ完全な不活化を確保するというバランスを見つける必要があります。前世紀の初め以来、科学者たちはさまざまな方法を用いて免疫原性不活化ワクチンを調製しようと絶えず試みてきました。ポリオウイルスワクチン、A型肝炎ウイルスワクチン、狂犬病ワクチンなど、これらのワクチンの多くはすでに利用可能で普及しています。

現在、不活化ワクチンの不活化方法は依然として化学試薬が主であり、その製造工程は大まかに、ウイルス増幅 - ウイルス不活化 - 化学試薬による解毒 - ウイルス精製 - アジュバント添加 - 瓶詰めとなっています。このプロセスは比較的伝統的に見えますが、研究開発プロセス中に解決すべき大きな困難がいくつかあります。

1. ワクチンを調製する前に、免疫効果が良好な安定した種子株を入手する必要があります。

2. ワクチンの免疫原性を確保するために、適切な不活化剤、投与量、処理方法を選択する必要があります。

3. 不活化ウイルスは高い基準で精製される必要がある。

4. 超大規模かつ迅速な大量生産をサポートするには、高いレベルの産業能力が必要です。

これらの要因により、典型的なワクチンが開発から市場に出るまでには通常約 10 年かかります。しかし、科学研究と技術レベルの進歩、そして時間の緊急性により、我が国が独自に開発・販売した不活化ワクチンは、新型コロナウイルスの最初の株を分離してから1年半も経たないうちに、世界保健機関から緊急使用許可を取得しました。

他のワクチンと比較して、不活化ワクチンは研究開発サイクルが短く、技術が比較的成熟しており、安全性がより保証されており、保管と輸送が容易であるなどの利点があります。しかし、不活化ワクチンにも独自の弱点がいくつかあります。たとえば、病原体の急速な変異による流行に対応するためには、変異株に対するワクチンを更新する必要があることがよくあります。核酸ワクチンの更新速度は不活化ワクチンよりも速い可能性があります。さらに、抗原安定性が低いウイルスの場合、従来の不活化方法では免疫原性が損なわれることが避けられません。ある研究によると、新型コロナウイルスを0.05％β-プロピオラクトン中で4℃で36時間培養したところ、その表面のタンパク質構造の74％が正しい免疫原性を失っていたことが判明した[18]。これは、不活化ワクチンの開発にはまだ大きな可能性があることを間接的に示しています。

パラホルムアルデヒド[6]とβ-プロピオラクトン[18]によって不活化された新しいコロナウイルスの構造と、細胞表面上のアデノウイルスワクチン誘導抗原発現の電子顕微鏡写真[19]。

図 A および B: パラホルムアルデヒド固定後のウイルスと比較すると、β-プロピオラクトン不活化により、スパイクタンパク質の構造が逆三角形 (円グラフの青) から長い柱 (円グラフのオレンジ) へと大きく変化する可能性があります。しかし、β-プロピオラクトン処理後のスパイクタンパク質はホルムアルデヒド処理後よりも自由度が高いため、この劇的な変化がウイルスの精製中に起こった可能性も否定できません。しかし、これはホルムアルデヒド不活化ウイルスの免疫原性が高くなることを意味するものではありません。研究によると、ホルムアルデヒド固定によりスパイクタンパク質上の受容体結合領域の露出が減少し、それが免疫反応の誘導に影響を与える可能性があることが示されている[20]。

図 C: 核酸ワクチンの一種であるアデノウイルスワクチンは、宿主細胞に直接抗原を発現させ、体の免疫反応を刺激することができます。この方法で導入された抗原は外界によって損傷されることはありません。写真は、アデノウイルスワクチンを接種した後、細胞の表面に多数の抗原が発現している様子を示しています。

見通し

不活性化はウイルスに対する私たちの積極的な武器です。直接的な消毒に加えて、不活化したウイルスを使用して自分自身に免疫壁を追加することもできます。不活化ウイルスワクチンの製造プロセスを改善する目標は、抗原構造を変えずに核酸のみを破壊し、低コスト、高スループット、無毒性の不活化方法を見つけることです。現在、さまざまな物理的不活化方法もワクチン開発において大きな可能性を示しており、いくつかの面では利点さえあります。まず、物理的な不活性化により新たな毒性が導入されず、調製中の解毒操作が不要になります。さらに、物理的不活化は適用範囲が広く、さまざまな種類のウイルスや急速に変異する可能性のあるウイルスにも適用できます。さらに、物理的不活性化は、良好な免疫原性を維持し、準備コストを低く抑え、スループットを高める研究開発の可能性を秘めています。すでに電離放射線を利用して不活化ワクチンを開発する例があり、ガンマ線で不活化したインフルエンザウイルス[15]やポリオウイルス[21]など、一定の開発可能性が示されている。

免疫学理論の継続的な蓄積と、さまざまな不活化技術の継続的な成熟により、近い将来、人類は流行病に直面したときに即座に対応し、迅速に消毒やワクチンの準備を行い、積極的に反撃し、ウイルスの拡散と伝染を防ぐことができるようになると信じています。

参考文献

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